Cultivo celular

  El cultivo celular es el proceso por el cual tanto células procariotas como eucariotas pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" ha venido a referirse al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos.

El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria en los laboratorios de los años 50,^[1] pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del cuerpo de origen fue descubierto en el siglo XIX.^[2]

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Historia

El fisiólogo inglés Sydney Ringer desarrolló en el siglo XIX una solución salina, conocida como solución de Ringer, que contiene cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio,^[3] dicha solución es capaz de mantener latiendo el corazón de un animal fuera del cuerpo.^[4] En 1885 Wilhelm Roux extrajo una porción de la médula de embrión de pollo y la mantuvo varios días en cultivo en una solución salina tibia, estableciendo el principio de los cultivos tisulares. Ross Granville Harrison, trabajando en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y más tarde en la Universidad de Yale, publicó los resultados de sus experimentos desde 1907 a 1910, estableciendo la metodología del cultivo tisular.

Las técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y 50, como soporte a la investigación en virología. Al crecer virus en cultivos celulares se permitió la preparación de virus purificados para la preparación de vacunas. La vacuna Salk de la polio fue una de los primeros productos producidos en masa usando técnicas de cultivos celulares. Esta vacuna fue posible gracias a la investigación de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins, estos fueron galardonados con el Premio Nobel por el descubrimiento de un método de crecimiento de virus en cultivos celulares de riñón de mono.

Conceptos en el cultivo de células de mamífero

Aislamiento de células

Las células pueden ser aisladas de los tejidos para cultivos ex vivo de muchas maneras. Las células pueden ser purificadas con facilidad de la sangre, sin embargo sólo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo. Las células mononucleares se pueden liberar de los tejidos blandos mediante hidrólisis enzimática con enzimas como la colagenasa, tripsina o pronasa, que degradan la matriz extracelular. Como alternativa se pueden colocar trozos de tejido en medio de crecimiento, y las células que crecen son aptas para el cultivo. Este método es el conocido como cultivo de explantos.

Las células que se cultivan directamente desde un sujeto se conocen como células primarias. A excepción de algunos derivados de tumores, la mayoría de los cultivos celulares primarios tienen un periodo de vida limitado. Después de un cierto número de divisiones las células entran en el proceso de senescencia y dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad.

Una línea celular establecida o inmortal ha adquirido la capacidad de proliferar indefinidamente bien debido a la mutación al azar o a una modificación deliberada, como la expresión artificial del gen de la telomerasa. Hay numerosas líneas celulares bien establecidas representativas de tipos celulares particulares.

Mantenimiento de células en cultivo

Las células se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases (habitualmente, 37 ºC, 5% CO₂ y 95% [[oxígeno diatómico|O₂) en un incubador celular. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la variación de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresión de diferentes fenotipos.

Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes derivados de la sangre plantean una potencial contaminación con virus o priones de los productos farmacéuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible.

Algunas células viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguineo. Otras necesitan una superficie, como la mayoría de células derivadas de tejidos sólidos. A las células que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensión. Algunos cultivos celulares adherentes pueden crecer en plástico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento.

Manipulación de las células en cultivo

Al estar generalmente las células en continua división durante el cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar todo el área o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:

• Agotamiento de los nutrientes del medio
• Acumulación de células apoptóticas o necróticas
• Inhibición de la división celular por contacto: los contactos entre células pueden desencadenar un arresto del ciclo celular
• Diferenciación celular promiscua provocada por los contactos intercelulares

Estos problemas pueden afrontarse mediante métodos de cultivo celular en esterilidad. El objetivo de estos métodos es evitar la contaminación con bacterias o levaduras que competirían con las células mamíferas por los nutrientes y/o podrían infectar y eliminar las células. Toda manipulación se lleva a cabo, típicamente, en una campana de flujo laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. También pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo.

Entre las manipulaciones más comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se encuentran los cambios de medio, el pase de las células y la transfección.

Cambios de medio

El objetivo de los cambios de medio es renovar los nutrientes y evitar la acumulación de productos metabólicos potencialmente tóxicos y de células muertas. En el caso de las suspensiones celulares, las células se separan del medio mediante centrifugación y se resuspenden en medio fresco. En los cultivos adherentes, el medio puede eliminarse directamente mediante aspiración y reemplazarse por el fresco.

Pase de las células

El pase de las células supone transferir un pequeño número de células a un nuevo continente. Las células pueden cultivarse más tiempo si se pasan regularmente, ya que así se evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular. Con cultivos en suspensión el pase se hace fácilmente, tomando una pequeña cantidad de cultivo que contenga unas pocas células y diluyéndola en un volumen mayor de medio fresco. En cultivos adherentes, las células han de ser inicialmente despegadas; esto se efectúa comúnmente con una mezcla de tripsina y EDTA, aunque actualmente existen otras mezclas de enzimas para esto. Un pequeño número de las células despegadas pueden sembrarse en un nuevo continente.

Transfección y transducción

Otro método común en la manipulación de las células es la introducción de un DNA externo por transfección. Esto se lleva a cabo a menudo para conseguir que las células expresen una proteína de interés. Más recientemente, la transfección de RNA interferentes se han llevado a cabo como mecanismos adecuados para suprimir la expresión de un particular gen.

El DNA también puede ser introducido en las células usando virus, en métodos llamados transducción, infección o transformación. Los virus, como agentes parásitos, son adecuados para introducir DNA en células, ya que esto forma parte de su ciclo normal de reproducción.

Referencias