Enzima de restricción

  Una enzima de restricción (o endonucleasas de Restricción) es una enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto llamado sitio o diana de restricción o en un sitio no muy lejano a este, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.

El mecanismo de corte de DNA se realiza a través del rompimiento de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, dando lugar a dos extremos de DNA, que pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que puedan haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).    

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los Plásmidos moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias.

Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas Isoesquizómeros. Por ejemplo, están los Isoesquizómeros Asp 718 y Kpn1.

El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los Microbiólogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las Endonucleasas de Restricción, conduciendo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.

Uno de los campos en los que el uso de Enzimas de Restricción ha tenido mayor implicancia ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas a cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de trozos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la Enzima de Restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte, con lo que al aplicar ésta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de trozos para cada caso en una electroforesis.

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Sistemas de Restricción-Modificación (M-R)

El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos que ingresen a la bacteria, distinguiendolo del ADN propio, análogo a un sistema inmune. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-Adenosil-Metionina (SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas “K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes:

Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exógenos para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas de restricción a los DNA exogenos que ingresen a la bacteria.

Modificación: Consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica.

Existen varios mecanismos de acción generales de estos sistemas, de los cuales se destaca el Tipo I y el tipo II:

M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo característico de los sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificación y las de restricción están producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades. Algunas características son:

• Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetrías.

• La actividad de restricción (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento (del orden de unos 1000 pb.), y en lugares inespecíficos.

• La restricción requiere de ATP.

• La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donor de los grupos metilo.

M-R tipo II: Aquí cada subunidad del dímero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del palíndromo, y realiza un corte en un lugar específico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palíndromo. Más de la tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados en plásmidos. Algunas características que tiene este mecanismo son:

• Las dos actividades las realizan dos proteínas distintas que no formas complejos multiproteicos.

• No utilizan ATP. Sólo necesitan iones Mg2+ para funcionar. La metilasa usa SAM como donor de metilos.

• Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia específica de ADN.

• El sitio de reconocimiento consta de 4 o 6 pb. que constituyen una secuencia palindrómica.

• La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en una A o en una G (según la metilasa en cuestión), en ambas cadenas, dentro del sitio de reconocimiento.

• La restrictasa suele ser una proteína formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simétricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o extremos romos. Algunas restrictasas dejan extremos protuberantes 5', mientras que otras dejan extremos protuberantes 3'.

Tipos de Enzimas de Restricción

Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:

Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aprox.), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.

Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, ceca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonamiento de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP.

Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli (Eco 571) que consta de una sola enzima que corta únicamente DNA metilado en una secuencia específica, y que ademas metila.

Nomenclatura

El nombre de cada enzima de restricción esta asignado según el origen bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en:

1º. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haempphilus influenzae (Hin) )

2º. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )

3º. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción.

4º. Todas deberían llevar delante una R de restricción o un M de metilasa según la función de la enzima, pero generalmente se omite.

De ésta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se construiría de la siguiente manera:

Así mismo, las enzimas HaeII y HaeIII provienen de Haemophilus aegyptius, MboI y MboII de Moraxella bovis, etc.

Ejemplos

En esta tabla se presentan algunas enzimas de restricción,con su respectivo origen bacteriano y sitio de reconocimiento.

5'GAATTC
3'CTTAAG

5'---G     AATTC---3'
3'---CTTAA     G---5'

5'GGATCC
3'CCTAGG

5'---G     GATCC---3'
3'---CCTAG     G---5'

   CH3
   |
5'GATC
3'CTAG
    |
    CH3

      CH3
      |
5'---GA     TC---3'
3'---CT     AG---5'
            |
            CH3

5'AAGCTT
3'TTCGAA

5'---A     AGCTT---3'
3'---TTCGA     A---5'

5'TCGA
3'AGCT

5'---T   CGA---3'
3'---AGC   T---5'

5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG

5'---GC   GGCCGC---3'
3'---CGCCGG   CG---5'

5'GANTC
3'CTNAG

5'---G   ANTC---3'
3'---CTNA   G---5'

5'GATC
3'CTAG

5'---     GATC---3'
3'---CTAG     ---3'

5'CAGCTG
3'GTCGAC

5'---CAG  CTG---3'
3'---GTC  GAC---5'

5'CCCGGG
3'GGGCCC

5'---CCC  GGG---3'
3'---GGG  CCC---5'

5'GGCC
3'CCGG

5'---GG  CC---3'
3'---CC  GG---5'

5'AGCT
3'TCGA

5'---AG  CT---3'
3'---TC  GA---5'

5'GATATC
3'CTATAG

5'---GAT  ATC---3'
3'---CTA  TAG---5'

5'GGTACC
3'CCATGG

5'---GGTAC  C---3'
3'---C  CATGG---5'

5'CTGCAG
3'GACGTC

5'---CTGCA  G---3'
3'---G  ACGTC---5'

5'GAGCTC
3'CTCGAG

5'---GAGCT  C---3'
3'---C  TCGAG---5'

5'GTCGAC
3'CAGCTG

5'---G  TCGAC---3'
3'---CAGCT  G---5'

5'GCATGC
3'CGTACG

5'---G  CATGC---3'
3'---CGTAC  G---5'

5'TCTAGA
3'AGATCT

5'---T  CTAGA---3'
3'---AGATC  T---5'

Referencias