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Estructuras lipídicas



Las estructuras lipídicas son conformaciones que le dan forma a las membranas plasmáticas, sus componentes principales son los lípidos, los cuales presentan características especiales que están condicionadas por factores termodinámicos como la temperatura. Una de las técnicas experimentales más utilizadas para el estudio de estas estructuras es la difracción de rayos X, ya que debido a las características de este tipo de radiación electromagnética se pueden inferir propiedades de la materia.

Tabla de contenidos

Estructura de la Membrana Lipídica

Todas las membranas biológicas están constituidas por lípidos y la cantidad presente de lípidos en las membranas varia dependiendo del tipo de tejido .

En general los lípidos consisten de una cabeza polar y una región de cabezas apolares constituyendo lo que se conoce como una sustancia anfifílica. Dependiendo de la complejidad de su molécula existen dos categorías de lípidos, simples y complejos. Los simples están conformados específicamente por Carbono, Hidrógeno y Oxígeno. Los complejos además de los elementos mencionados presentan también Nitrógeno, Fósforo o Azufre.

Las membranas lipídicas se componen principalmente de fosfolípidos que usualmente se componen de cabezas cargadas y cadenas hidrocarbonadas que no pueden interactuar con el agua. Debido a esta estructura especial, los fosfolípidos al interactuar en una solución acuosa sufren interacciones hidrofóbicas que se pueden definir como el conjunto de factores termodinámicos que son responsables del secuestro de los grupos no polares de un medio acuoso, las cuales hacen que las cadenas hidrocarbonadas tiendan a unirse entre sí, formando estructuras que aseguran un mínimo contacto con el agua incrementando la entropía del sistema.

Fases de las Estructuras Lipídicas de Membrana en Sistemas Acuosos

Debido a las interacciones hidrofóbicas los lípidos se pueden encontrar en las siguientes fases que dependen de las concentraciones de lípidos monoméricos que se encuentran en el medio acuoso, así como de la temperatura.

Lípidos Monoméricos

 

Como su nombre lo indica se pueden encontrar monómeros de lípidos en el medio acuoso que van a depender directamente de consideraciones entrópicas.

Micelas

Cuando la concentración de fosfolípidos monoméricos supera la superficie del medio acuoso se forman estructuras llamadas micelas. Estas micelas pueden existir en diferentes tamaños y su núcleo esta compuesto por un pequeño volumen de hidrocarburo puro capaz de disolver sustancias no polares, mientras que la superficie polar asegura la solubilidad de la micela en agua. Se puede aproximar el proceso de formación por medio de ley de acción de masas.


Fase Laminar

A concentraciones altas y como un proceso espontáneo y producto del medio acuoso las micelas se conforman en hojas extendidas de dos dimensiones llamadas bicapas. Bajo tal definición de bicapa, estas pueden existir en dos estados principales que varían dependiendo de la temperatura de la siguiente forma.

Fase Lc o Lβ

Llamada fase cristalina (sólida) o gel, en esta conformación las cadenas acil de los fosfolípidos están totalmente extendidas paralelas a la normal de la bicapa en la forma trans y las moléculas se empaquetan juntas en un arreglo casi hexagonal, en esta conformación no hay separaciones de capas de agua.

Fase Lβ'

Esta fase es una variación de la fase cristalina Lβ denominada fase sólido-ordenada debida al aumento de temperatura. En este caso las cadenas acil no solo están totalmente extendidas sino que presentan una inclinación con respecto a el plano normal, esta declinación depende de la cabeza del grupo del acido graso. En el estudio de la estructura de Lβ con fosfatidilcolina, que es el mayor componente de muchas membranas biológicas, se encontró que estas bicapas tienen una inclinación de alrededor de 30°. Los lípidos se conforman en una especie de enrejado triangular de dos dimensiones en el plano de las membranas.

Fase Pβ'

Al aumentar la temperatura la Lβ' sufre cambios de configuración, aparece la fase Pβ' la cual presenta ondulaciones en la superficie de la membrana, es conocida como la fase de la onda. Las ondas son producto de arreglos periódicos de la fase Lβ' y la fase Lα que se tratará más adelante, en este estado la fase Lβ' presenta una inclinación menor que la que tiene habitualmente.

Fase Lα

Es también llamada fase fluida o liquida cristalina y se da a las temperaturas más altas en la membrana. En esta etapa las cadenas están principalmente desordenadas y el orden tiende a perderse. Este desorden es debido a la presencia de isómeros rotacionales alrededor de los enlaces C-C de las cadenas acil de las grasas, para formar isómeros deformes que son el resultado de la rotación de 120° alrededor de los enlaces C-C. Estos isómeros rotacionales producen torceduras en la conformación de la cadena acil.

Fase Cúbica

La fase cúbica lipídica es principalmente una fase bi-continua de bicapas lipídicas con orden periódico tridimensional, estas son estructuras unilamelares. Hay en principio 36 posibles espacios cúbicos permitidos para las fases relacionadas.

Fase Hexagonal Inversa

Esta fase que también se da a altas temperaturas es debida a un aumento de la entropía llevando a que los lípidos formen cilindros con las cadenas directamente hacia fuera. Subsecuentemente las cadenas tienden a evitar el agua en los arreglos cilíndricos en dos dimensiones.

Métodos de análisis de estructuras lipídicas

En los últimos 30 años y más en las dos últimas décadas, la utilización de la difracción de rayos X ha aumentado el desarrollo en ciencias como la biología molecular y la tecnología mostrando resultados sobre la estructura de los ácidos nucleicos y las proteínas. Gracias a estos adelantos la técnica de los Rayos X ha expandido su campo de aplicaciones, como es el estudio de las membranas biológicas y por consiguiente la estructura de los lípidos. Las principales técnicas y aplicaciones de difracción de Rayos X con lípidos son.

Análisis de cristal simple

Este método con la última resolución estructural, tiene el potencial inequívoco para evaluar la posición precisa de los átomos, excepto para el hidrógeno ya que son casi inadvertidos para los rayos X. Esta técnica se aplica solo para cristales simples bien desarrollados. El cristal en este caso se trata de una muestra de biológica de lípidos extraídos de algún microorganismo específico.


Difracción de rayos X difracción Powder para pequeños y grandes ángulos

Cuando los ácidos grasos y los lípidos no están en estado líquido, son normalmente materiales policristalinos, es decir consisten de dominios cristalinos orientados de forma aleatoria separados de regiones desordenadas. Estos cristales varían de tamaño y forma y pueden alcanzar dimensiones submilimétricas. Una fuente de rayos X con una gran sección de traspaso con la de de la muestra golpeará simultáneamente todas las orientaciones de los cristales y en algún tiempo dado todas las posibles reflexiones de Bragg serán excitadas. La difracción powder varia dependiendo de la forma del barrido (para ángulos grandes y para ángulos pequeños), aunque en definición son lo mismo se diferencian en que los rangos de resolución son muy diferentes. Como las moléculas de lípidos son más bien anisotrópicas y frecuentemente anfifílicas lo que lleva a empaquetamientos característicos con espaciamientos cortos y largos, los espaciamientos corresponden a las separaciones de las cabezas de las cadenas hidrocarbonadas, las cuales forman rejillas y están en un rango de distancia de 3 a 5 Å, los espaciamientos largos corresponden al largo de la bicapa, incluyendo la separación entre capa y capa y están en un rango de 20 a 60 Å. Cuando se realizan variaciones de temperatura es posible utilizar este método para realizar diagramas de fase, par estudiar interacciones con aditivos y para observar cambios de fase.

Esparcimiento difusivo para ángulos pequeños

El esparcimiento difusivo para ángulos pequeños o SAXS (en inglés) ocurre siempre para materiales que contienen fluctuaciones de densidad no cristalina a una escala de longitud coloidal, es decir la escala de los nanómetros. Como hay ausencia de una estructura cristalina una grafica de intensidad contra número de onda se caracteriza por curvas continuas y ausencia de picos que representen fenómenos de difractivos. Se utiliza para conocer información sobre el tamaño y la forma de lípidos de micelas o vesículas a baja resolución. Se utiliza siempre que no se tienen ni cristales ideales ni cristales líquidos, como lipoproteínas o mezclas solubles de micelas.

Difracción Superficial

Este método arroja un perfil de la densidad electrónica de la superficie de una monocapa a baja resolución, como también para arreglos de en el planote las cadenas hidrocarbonadas. Es la única técnica para estudiar la estructura de películas superficiales para lo cual es necesario utilizar Radiación sincrotrón|radiación sincrotrónica.

Difracción en Membranas Bicapa

Los lípidos en soluciones acuosas se encuentran en fase laminar y estas bicapas pueden estar separadas unas de otras de tal manera que realicen conformaciones periódicas. Con experimentos de Difracción de Rayos X y en especial el método de Powder se puede hallar la amplitud y la intensidad de los haces dispersados.


Si consideramos la Ley de Bragg para una distribución ordenada de electrones ρ(r), como muestra la figura podemos obtener la amplitud para la onda dispersada, también llamada amplitud o factor de estructura.

F(R)=\int_{\mathbf r}{\rho(r) e^{{2 \pi i r\cdot R}}\,dr}

Si consideramos un arreglo de lípidos en fase laminar, la distribución de electrones es continua en el plano yz. Así, sólo en la dirección x, los electrones no poseen una continuidad puesto que esta varía entre las cabezas de los lípidos, las colas y el medio acuoso.

Por lo tanto la amplitud de la onda sólo es función de x. F(R)=\int_{\mathbf x}{\rho(x) e^{{2 \pi i x\cdot R}}\,dx} Donde F(R) es la transformada de Fourier para ρ(r). es decir

\rho(x)=\int_{\mathbf R}{F(R) e^{{-2 \pi i x\cdot R}}\,dR}


Ahora para un conjunto de bicapas como el de la figura de la derecha, la densidad que se encuentra en la ecuación anterior se repite a distancia D. Obteniendo ahora para la densidad y el factor de escala

\rho(x+nD)=\rho(x)\,\,\,\,0\le x\le D \,\,y \,\,h=1,2,3,... y


F(R)=\underbrace{\left( \sum_{i = 1}^{N-1}e^{{2 \pi iRnD}}\right)}_{G(R)}\underbrace{\int_{x=0}^{D}\rho(x) e^{{2 \pi i x\cdot R}}}_{F_{u}(R)}

Donde Fu(R) es el factor de estructura para una sola bicapa de lípidos ( que ) y (G(R)) que puede también escribirse como

\sum_{i = 1}^{N-1}e^{{2 \pi iRnD}}=e^{\pi iR(N-1)D} \frac{sen(N\pi RD)}{Sen(\pi RD)}

Para un máximo de interferencia, la función G(R) esta dada por

|G(R)|= \left| \frac{sen(N\pi RD)}{Sen(\pi RD)} \right|= N

y sus picos máximos cuando R=m/D, donde m es un número entero.

La intensidad de la onda dispersada en experimentos de dispersión puede ser medida, esta a su vez es igual a la norma al cuadrado del factor de escala.

I(R) = F * F(R) = | F(R) | 2

Si consideramos a una bicapa simétrica con respecto a su centro, podemos escribir su factor de estructura. F_{u}(R)=\int_{-D/2}^{+D/2}\rho(x) cos(2\pi ixR)\,dx + i\int_{x=-D/2}^{+D/2}\rho(x) sen(2 \pi ixR)

Como la función sen(x) es una función par podemos omitir el segundo termino de la derecha ya que este es igual a cero. De esta manera, la solución para el factor de escala puede tomar tanto valores positivos como negativos. Para determinar el signo se debe realizar no sólo un experimento de difracción. Así, asignar valores apropiados para el factor de escala y con los datos de intensidad, se puede hallar la densidad electrónica a lo largo del eje x de las multicapas.

Las figuras de la derecha muestran los datos obtenidos de un típico experimento de difracción. Se puede observar que la densidad electrónica en las cabezas de los lípidos es mucho más grande que en el centro. Se puede explicar esto debido a que en las cabezas de los lípidos contienen muchos átomos de carbono a diferencia de sus colas, así:

Densidad de electrones en la cabeza del grupo \approx \frac{0.45electrones}{\AA ^{3}}

Densidad de electrones de un grupo − CH3 − de las cadenas de lipidos \approx \frac{0.17electrones}{\AA ^{3}}

Protocolo Experimental para realizar Difracción de Rayos X en Estructuras Lipídicas

El siguiente protocolo permite realizar extracción de muestras lipídicas de muestras biologicas de E. coli que posteriormente se utilizan para realizar difracción de rayos X.

Materiales

  1. Cloroformo
  2. Etanol
  3. Agua destilada
  4. Cloruro de Calcio
  5. Benceno
  6. Na2CO2
  7. Cultivo en Agar-Agar|Agar de la bacteria E. coli
  8. Medio LB. (5g/l NaCl, 5 g/l extracto de levadura y 10g/l triptona).


Cultivo y aislamiento de células

Para aislar las células se debe homogeneizar la muestra biológica, para ello, se retira del cultivo de agar una pequeña muestra biológica mediante una asa, previamente esterilizada en la llama. La muestra es depositada en Medio LB, en una atmósfera estéril (i.e. cerca de un mechero de gas) y se cultivan en medio LB y se ponen en un shaker en crecimiento por 24 horas a 28°C.

Preparación de la muestra Biológica

Las células se deben centrifugar del medio de cultivo, depositando la muestra cultivada en Ependoph mediante micropipeta con puntas no necesariamente estériles, de poderse centrifugar toda la muestra, obteniéndose un pellet de bacterias. La células se lavan en una solución salina que contiene NaCl a una concertación 0.87% en una solución con CaCl2 a 30 μMolar. Las células se resuspenden y se centrifugan tres veces para garantizar que estén limpias del medio de cultivo.


Extracción de Lípidos

Por medio de una mezcla de cloroformo, etanol y agua se separan los lípidos de las proteínas y se extraen las muestras lipídicas mediante jeringas Hamilton. Se realiza un proceso de limpieza con cloroformo y Na2 CO2 para remover el residuo de ácidos grasos insaturados.

Las muestras de lípidos son montadas en un delgado tubo capilar o en un porta muestras.

Bibliografía

  • Antonio Blanco (2000), Qumica Biológica, Buenos Aries Editorial El Ateneo.


  • Torres, Héctor N. (1983), Bioquímica general, Buenos Aries Editorial El Ateneo.


  • M.D. Houslay & K.K.Stanley (1982), Dynamics of Biological Membranes, Jhon Wiley & Sons.
  • Richard J. Hamilton and John Cast (1999), Spectral Properties of Lipids, Sheffield Academic Press.
  • Thomas Heimburg (2007), Thermal Biophysics of membranes, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.
 
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