PCR cuantitativa

La PCR cuantitativa, PCR en tiempo real o qPCR (del inglés quatitative polimerase chain reaction) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la cual se cuantifica de forma absoluta o relativa el producto de la amplificación de ADN (o, lo que es lo mismo, el amplicón). Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, unos cebadores específicos, dNTPs, un tampón adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluorocromo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia, permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.^[1] En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc) obtenido por transcripción reversa de ARN; de este modo, lo que se está efectuando es una RT-PCR cuantitativa.

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Cuantificación

A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite cuantificar el grado de producto obtenido en cualquier momento de la amplificación mediante la señal de fluorescencia (en realidad, mediante su nivel sobre un umbral). Los valores de fluorescencia, expresados como logaritmos a fin de detectar la fase exponencial de amplificación, permiten analizar ésta fácilmente como una línea recta; este segmento, denominado segmento cuantificable, permite valorar la cantidad de ADN inicial.

Gráfica e la izquierda (A)

Las cinéticas de tres PCR de tres muestras distintas (K, L y M) de concentraciones de ADN inicial decrecientes (concretamente, se reducen a 1/10 cada vez) se representan en un gráfico del logaritmo de la fluorescencia (en ordenadas) frente al ciclo de PCR (en abscisas). No se representan las fases previas a la exponencial.

1. 1 Zona de segmentos cuantificables de cada muestra. En gris la zona de saturación, fuera ya de la zona lineal.
2. 2 Cada uno de los segmentos cuantificables permite definir una ecuación de la recta de tipo U=ax+b, que permite modelizar la eficiencia de la amplificación (la pendiente a) y, mediante la ordenada en el origen b, la cantidad de ADN en el ciclo 0, al menos teóricamente.
3. Si bien, puesto que las medidas experimentales conllevan un error, dicha cuantificación arrastra un error estocástico. Si las muestras de concentraciones K, L y M fueran emplificadas más, se obtendrían cinéticas diferentes, si bien bastante próximas (ser representan sus segmentos cuantificables en rojo, rosa y naranja). Cada una de estas medidas permite establecer una nueva ecuación, representada en puntos del mismo clor. Las ordenadas en el origen (b) diferentes son también medidas. Así, podemos evaluar el error o incertidumbre de la técnica evaluando las diferencias entre las pendientes b (EK, EL, EM).

Referencias