Replicación de ADN

El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse. Esta duplicación del material genético recibe el nombre de replicación semiconservativa debido a que las dos cadenas complementarias del ADN parental, al separarse, sirven de molde a su vez para la síntesis de una nueva cadena, complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas del ADN parental. Gracias a la complementariedad entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una célula madre a las células hijas y es la base de la herencia del material genético.

La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias liberándose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria añadiendo nucleótidos que se encuentran dispersos en el núcleo. De esta forma, cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.

La replicación empieza en puntos determinados: los orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.

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Características generales

Semiconservativa

En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas parentales, y por eso se dice que la replicación del ADN es semiconservativa. Hasta que finalmente se pudo demostrar que la replicación es semiconservativa, se consideraron tres posibles modelos de replicación:

• Semiconservativa (correcta). En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas parentales.

• Conservativa. Se sintetiza una molécula totalmente nueva.

• Dispersiva. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.

  El experimento de Meselson-Stahl permitió demostrar la hipótesis de que la replicación es semiconservativa. Para ello se hicieron crecer células de Escherichia coli en presencia de Nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual. En consecuencia, el isótopo se adhirió a las cadenas de ADN, haciéndolas más pesadas.

Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que contenía Nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, y se les dejó replicarse. El ADN fue extraído para hacer una centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay más densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo.

En la primera generación (figura 2.b) se obtuvo una única banda de ADN con densidad intermedia. En la segunda generación (figura 2.c) se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra con densidad intermedia o semihíbrida. En la tercera generación se obtuvieron dos bandas, una ligera (que ocupaba el 75%) y otra intermedia (que ocupaba el 25% restante).

La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (parental) y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no estaban cuando las células se pusieron en presencia de nitrógeno-15.

El hecho de que cada vez haya más cadenas ligeras y se mantenga el número de cadenas intermedias demuestra que la replicación del ADN es semiconservativa. Si fuera conservativa, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersiva sólo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.^[1]

Secuencial y bidireccional desde puntos fijos

Los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial con estructuras con forma de horquilla. Por otro lado, la replicación se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambas direcciones.

El origen de replicación

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina replicón o unidad funcional de replicación. El genoma bacteriano es un replicón único circular. En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.^[2]

  Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contenía timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A continuación se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).^[3]

Secuencialidad

Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de mutaciones que permitieron determinar que desde los orígenes la replicación avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular, además de ser fácilmente transformables. El método consistía en transformar cepas salvajes con cepas mutantes que no fueran capaces de sintetizar determinados aminoácidos. Conociendo la localización de los codones que los codifican en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias transformantes en medio mínimo (para que sólo pudieran crecer éstas), al extraer ADN a diferentes tiempos se observó que, tras la última extracción, aparecía con mayor frecuencia el gen de uno de los aminoácidos (el correspondiente a la "posición 1"), con una menor frecuencia el gen del aminoácido adyacente al primero ("posición 2"), el adyacente al segundo ("posición 3") aparecía con menor frecuencia que el segundo y así sucesivamente hasta el gen que ocupaba la última posición. El experimento permitió demostrar, a partir de las frecuencias relativas de transformamiento, que la replicación sigue un orden (es secuencial).

La replicación avanza en forma de horquilla

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de replicación (también llamada estructura θ cuando el ADN es circular debido a la similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados intermedios de replicación, no obstante pudiendo aparecer estructuras alternativas),^[3] que avanza en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás los dos moldes de ADN de cadena simple donde se está produciendo la replicación.^[2]

Bidireccionalidad

El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambas direcciones. Esto ocurre en la mayoría de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicación que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, de cadena doble o cadena simple).^[3] Así, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plásmidos o algunos genomas de cadena simple de fagos pequeños, la replicación se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orígenes de replicación. 

No obstante, la replicación se puede considerar, de forma general, bidireccional.

La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una técnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se añade timidina marcada y luego sin marcar, y siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dónde se ha replicado la molécula de ADN.^[3] También se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicación es unidireccional o bidireccional. Otras técnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicación hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restricción).

Semidiscontínua

La replicación siempre se da en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.

Este problema lo resolvió Reiji Okazaki en la década de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud puede variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en eucariontes.

La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que la horquilla de replicación se denomina hebra conductora o adelantada y es sintetizada de forma continua por la ADN polimerasa mientras que la que se sintetiza en sentido contrario se denomina hebra rezagada, cuya síntesis es realizada de forma discontínua teniendo que esperar a que la horquilla de replicación avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde.^[2]

Experimentos de Okazaki

Actividades enzimáticas

ADN polimerasas

La síntesis de la nueva cadena de ADN es llevada a cabo por ADN polimerasas, que emparejan los desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP) con la base complementaria correspondiente del ADN molde. Los dNTP que se usan en la replicación del ADN contienen tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5' de la desoxirribosa y dependiendo de la base nitrogenada serán dATP, dTTP, dCTP o dGTP. La reacción fundamental es una transferencia de un grupo fosfato en la que el grupo 3'-OH actúa como nucleófilo en el extremo 3' de la cadena que está en crecimiento. El ataque nucleofílico se produce sobre el fosfato α (el más próximo a la desoxirribosa) del desoxirribonucleósido 5' trifosfato que entra, liberándose pirofosfato inorgánico y alargándose el ADN (enlace fosfodiéster).^[2] A diferencia de la mayoría de procesos biológicos que ocurren en la célula en los que sólo se separa un grupo fosfato (P_i), durante la replicación se separan los dos últimos grupos fosfato, en forma de grupo pirofosfato (PP_i).

Este proceso se puede resumir en una ecuación química:

(DNA)_n + dNTP ↔ (DNA)_n+1 + PP_i

A pesar de que la ADN polimerasa sólo tiene un sitio activo para emparejar los cuatro dNTPs diferentes, la unión correcta de los pares de bases A:T, C:G es posible basándose en la geometría de éstos: si la unión es incorrecta se produce un desplazamiento del fosfato α haciendo más difícil su unión al extremo 3'-OH y ralentizando así el ritmo de catálisis, lo que da lugar a que la ADN polimerasa añada preferentemente las bases correctas.^[2]

Las ADN polimerasas pueden añadir hasta 1000 nucleótidos por segundo. Esto es debido a su naturaleza procesiva, es decir, el número de nucleótidos que son capaces de añadir cada vez que se asocian al molde de ADN que van a copiar. Dado que la adición de los nucleótidos es un proceso que dura unos milisegundos, la velocidad de catálisis va a depender del tiempo que la ADN polimerasa permanece unida al ADN, esto es, de su procesividad.^[2]

  El crecimiento de la cadena se da en dirección 5' → 3', ya que se requiere de un grupo 3'-OH libre para el inicio de la síntesis puesto éste es el que realiza el ataque nucleofílico sobre el fosfato α del dNTP, de forma que las ADN polimerasas requieren de un iniciador 3'-OH (que puede ser de ADN o ARN) llamado cebador que es sintetizado por la ARN primasa. El extremo 3' del cebador se denomina extremo cebador.^[2]

Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación. Además de participar en la elongación, desempeñan una función correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa, que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de éste.^[2] Es importante que existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a mutaciones.

ADN polimerasas de E. coli

Las principales ADN polimerasas en E. coli son las ADN Pol I, ADN Pol II y ADN Pol III y cada una de ellas está especializada en una o más de estas funciones según cuál sea su papel en la replicación. Así, la ADN Pol I que es poco procesiva (añade entre 20 y 100 nucleótidos por acontecimiento de unión) es la encargada de la eliminación de los cebadores y la posterior reparación del ADN (actividad exonucleasa 5' → 3' y actividad polimerasa 5' → 3') además de la corrección de los nucleótidos mal apareados (actividad exonucleasa 3' → 5'), la ADN Pol II está encargada de la reparación de ADN (actividades exonucleasa 5' → 3' y 3' → 5') y la ADN Pol III que es muy procesiva es la principal encargada de la elongación del ADN (actividad polimerasa 5' → 3') aunque también interviene en la corrección (actividad exonucleasa 3' → 5').^[3]

  A diferencia de lo que ocurre con la ADN Pol I, que sólo debe añadir unos 5-10 nucleótidos una vez eliminado el cebador, es importante que la ADN Pol III sí sea muy procesiva, y por esa razón suele formar parte de un complejo denominado Holoenzima ADN Pol III que le da una mayor procesividad.^[2] Este complejo consta de diversas subunidades polipeptídicas encargadas cada una de una función, y que constituyen en su conjunto un dímero asimétrico: una mitad se encarga de la síntesis de la hebra conductora y la otra mitad de la hebra rezagada. El corazón catalítico lo componen las subunidades α que corresponden a dos copias de la ADN Pol III, la subunidad ε con actividad correctora exonucleasa 3' → 5' y la subunidad θ cuya función podría ser la de ensamblar las otras dos; las subunidades τ mantienen la estructura dimérica; el complejo γ lo conforman las subunidades γ y δ cuya su función es la de aumentar la procesividad de la ADN Pol III; la subunidad β sujeta la ADN Pol III al ADN.^[3]  

ADN polimerasas eucarióticas

Hay 5 tipos aunque las más importantes son dos:

 -ADN polimerasa alfa: Se encuentra en el núcleo celular, se inhibe por alidilcolina y en humanos presenta 4 subunidades, aunque las más importantes son dos:
      
      * Subunidad mayor (130 kDa): tiene actividad polimerasa
      * Subunidad menor (48 kDa): tiene un centro activo de primasa para                            sintetizar el cebador necesario para la replicación pero carece de actividad exo 3'->5' por lo que no corrige errores.

 -ADN polimerasa sigma: Se localiza en el núcleo celular y se inhibe mediante alidilcolina. Tiene una o dos subunidades dependiendo el organismo.
  Tiene una alta capacidad de polimerización y actividad correctora de errores ( exo 3'->5'). Carece de actividad primasa.

La ADN polimerasa alfa sintetiza cebadores de aRN y comienza a elongar las dos cadenas. Después se produce un cambio de polimerasa y entra la ADN polimerasa sigma, que continúa la síntesis.

El complejo de replicación

La horquilla de replicación

Las pinzas deslizantes

Síntesis coordenada de las dos cadenas

Proceso

El proceso tiene 3 fases bien diferenciadas: Iniciación, Elongación y Terminación.

Replicación en E. coli

Iniciación

Para que pueda formarse la horquilla de replicación es necesario que las dos cadenas se separen para sintetizar el cebador y el ADN de la cadena de nueva síntesis. Para ello el ADN debe desenrollarse y el punto de partida viene determinado por una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación; en E. coli, el origen de replicación se conoce como OriC. Esta secuencia contiene gran cantidad de adenina y timina que facilita el desenrollamiento y es reconocida por proteínas iniciadoras que controlan este proceso, de forma que una vez se ha unido la proteína iniciadora al ADN, ésta provoca el desenrollamiento de estas regiones de fácil desnaturalización.^[2]

A continuación las proteínas iniciadoras reclutan el resto de proteínas que conforman el replisoma y que son necesarias para la síntesis de ARN y ADN, empezando por la helicasa. Esta enzima, generalmente con forma de anillo y de alta procesividad, se une a la región de ADN de simple cadena resultante del desenrollamiento, desplazándose a lo largo de ésta mediante consumo de ATP en dirección a la horquilla de replicación, es decir, en dirección 5' → 3' en la hebra rezagada y 3' → 5' en la hebra conductora, rompiendo los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble hélice.^[3] El siguiente conjunto de proteínas reclutadas son las denominadas proteínas SSB (single-stranded DNA binding proteins) encargadas de la estabilización del ADN monocatenario generado por la acción de las helicasas, impidiendo así que el ADN se vuelva a naturalizar o forme estructuras secundarias de manera que éste pueda servir de molde. Estas proteínas se unen preferentemente junto a otras SSB ya unidas al ADN por unión cooperativa permitiendo que su unión a la cadena conforme avanza la helicasa sea rápida, y estabilizando, además, su propia unión a la cadena. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se va generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN para relajar la tensión producida por el aumento del número de enlace o número de veces que se entrecruzan las dos cadenas, y si éstos no fueran eliminados, llegado a un punto la horquilla ya no podría seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada, sellando a continuación la brecha.^[2]

Elongación

En el siguiente paso, la Holoenzima ADN Pol III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo nucleótidos sobre el molde. Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada una de las horquillas de replicación que avanzan en sentido opuesto dentro de cada burbuja. Cuando dos horquillas adyacentes se encuentran, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.

Puesto que la Holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formación de un fragmento corto específico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cada horquilla de replicación se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que sólo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la replicación sólo puede ser continua en la hebra conductora o cadena líder; en la hebra rezagada es, por un lado, discontínua, dando lugar a los Fragmentos de Okazaki), y por otro, antiparalela, es decir, se da en el mismo sentido 5' → 3' pero en "sentido" contrario al de la síntesis de la primera.

La mitad del dímero de la Holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra conductora y la otra mitad la hebra rezagada.^[3]

Terminación

   En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro Fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de éste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación de cebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis contínua, pero debido a que en ésta hay un sólo cebador es un proceso que sólo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya. Para ello intervienen una serie de enzimas: la enzima ARNasa H ("H" de Híbrido ARN-ADN) elimina el cebador a excepción del ribonucleótido directamente unido al ADN; la ADN Pol I elimina este ribonucleótido gracias a su actividad exonucleasa 5' → 3' y rellena el hueco con ADN quedando una molécula completa a excepción de una rotura entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena reparada; por último, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando las reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y la desoxirribosa de los nucleótidos contiguos, creando un enlace fosfodiéster mediante el uso de ATP.^[2]

Terminación de los genomas lineales

Replicación en eucariotas

Diferencias con la replicación en E. coli

Proteínas que participan

La iniciación de la replicación siempre acontece en un cierto grupo de nucleótidos, el origen de la replicación, requiere entre otras de las enzimas helicasas para romper los puentes hidrógeno y las topoisomerasas para aliviar la tensión y de las proteínas de unión a cadena simple para mantener separadas las cadenas abiertas. Una vez que se abre la molécula, se forma una área conocida como "burbuja de replicación" en ella se encuentran las "horquillas de replicación" . Por acción de la la ADN polimerasa los nuevos nucleótidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucleótido correspondiente de la cadena de origen (A con T, C con G). Los procariotas abren una sola burbuja de replicación, mientras que los eucariotas múltiples. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de las "burbujas". Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicación procede solo en la dirección 5'-3' en ambas cadenas, numerosos experimentos mostraron que, una cadena formará una copia continua, mientras que en la otra se formarán una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki . La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena adelantada y, la que se sintetiza en fragmentos, cadena atrasada. Para que trabaje la ADN polimerasa es necesario la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeñas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posteriori, cuando la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de ARN, colocan nucleótidos de ADN en su lugar y, una ADN ligasa los une a la cadena en crecimiento.

Elongación

La ARN polimerasa cataliza la elongación de cadena del ARN. Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN, y para que se formen correctamente los enlaces de hidrógeno que determina el siguiente nucleótido del molde de ADN, el centro activo de la ARN polimerasa reconoce a los ribonucleótidos trifosfato entrantes. Cuando el nucleótido entrante forma los enlaces de hidrógeno idóneos, entonces la ARN polimerasa cataliza la formación del enlace fosfodiéster que corresponde. A esto se le llama Elongación, la segunda etapa de la transcipción del ARN.

Terminación

Replicación de los telómeros

Replicación del ADN mitocondrial

Referencias

Enlaces externos

• Animación sobre la replicación en E. coli