Secuenciación 454

La secuenciación 454 de 454 Life Sciences es una tecnología de determinación de secuencia de DNA a gran escala, aplicable a genomas completos, mediante luminiscencia. A diferencia del sistema de Sanger, capaz de resolver 67000 bases cada hora,^[1] el método 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5 horas, lo cual abarata enormemente el coste del proceso.^[2]

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Fundamento

La muestra biológica se carga en una placa «PicoTiterPlate Device», de fibra óptica, que permite transmitir la luz producida por quimioluminiscencia durante la reacción de secuenciación hasta la cámara CCD de captación de imágenes. Dicha placa, en forma de panal, posee multitud de pocillos.

Un inconveniente de la técnica es el limitado tamaño del DNA a secuenciar en cada pocillo: debe ser menor o igual a 100 nucleótidos .^[1] La genoteca de DNA genómico con la cual comenzar la secuenciación se carga en la placa; en ella, cada clon se amplifica mediante PCR basada en emulsión de modo que se amplifique hasta 10 millones de veces; este incremento facilita la detección de la señal.^[2]

El proceso de secuenciación se basa en el flujo secuencial de nucleótidos sobre la placa en combinación con un sistema de detección bioquímico que permite convertir los productos generados durante la incorporación de nucleótidos en luz detectable por el dispositivo CCD.

Luminiscencia

La inyección de los dNTPs en cada pocillo acarrea la interacción con al menos un nucleótido complementario al situado en ese punto del DNA de secuencia desconocida, esto es que para cada punto de la secuencia sólo un dNTP puede ser individualmente unido de forma correcta, y cada vez que esto sucede el establecimiento de un enlace químico provoca la liberación de una molécula de pirofosfato.^[1]

En cada pocillo de la placa PicoTiter se añade, además del DNA molde, el enzima luciferasa, que, en contacto con el pirofosfato, genera un haz de luz que indica la secuencia para ese punto.^[2]

Implicaciones

Su bajo coste y velocidad, que permitió a la compañía secuenciar el código de un adenovirus en 2003 en un sólo día,^[1] plantea la posibilidad de secuenciar genomas completos de forma rutinaria, lo cual es de especial interés en biomedicina. De hecho, el genoma de James Watson, codescubridor de la estructura del DNA, fue descrito y publicado mediante esta técnica.^[3]

Referencias

Enlaces externos

• Patente en Estados Unidos
• Animación Flash explicativa